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Mesure de la translocation d’antibiotiques à travers les porines par résonance paramagnétique électronique (RPE)

Type d'annonce : Offre de stage

De : BIP et MCT , IM2B, Marseille - site internet

Etat actuel des connaissances sur le sujet :

La résistance bactérienne aux antibiotiques représente une menace croissante pour la santé humaine et animale dans le monde entier. En Europe, celle-ci est responsable d’environ 25 000 morts par an ; et les frais médicaux associés aux coûts sociaux qui en résultent sont estimés à quelques 1,5 milliards d’euros par an. De nouvelles formes de résistance apparaissent et se répandent, laissant aux cliniciens peu de possibilités pour contrôler les infections. En même temps, malgré le besoin reconnu de développer de nouvelles molécules efficaces, la réalité est telle que seulement deux nouvelles classes d’antibiotiques ont été introduites sur le marché au cours de ces trois dernières décennies. Sur le plan scientifique, il est urgent de mieux comprendre comment les antibiotiques fonctionnent, comment la résistance se développe, et quels mécanismes moléculaires pourraient être exploités pour détourner la résistance bactérienne. Entre 2013 et 2018, le programme de recherche européen IMI-TRANSLOCATION visait à mieux comprendre le transport et l’accumulation des antibiotiques ainsi que l’émergence de la multirésistance chez les bactéries à Gram-négatif problématiques appartenant au groupe de pathogènes ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.). Des résultats significatifs ont été obtenus concernant (i) la translocation des antibiotiques à travers les porines générales de la membrane externe ; (ii) l’impact des pompes d’efflux sur l’accumulation et l’activité des antibiotiques chez les entérobactéries.

 

Problématique du projet proposé et approche rationnelle :

L’efficacité des antibiotiques dépend de leur capacité à s’accumuler à l’intérieur des bactéries jusqu’à ce qu’ils atteignent une concentration seuil pour interagir avec leur(s) cible(s) et inhiber leur activité. Cependant, la membrane externe des bactéries à Gram négatif est très imperméable et les antibiotiques diffusent à travers le canal étroit des porines. Mais ils sont en même temps des substrats de pompes d’efflux transmembranaires qui les expulsent1. Ainsi, de nombreux isolats cliniques multirésistants aux antibiotiques présentent des modifications fonctionnelles ou une perte des porines, associées à une surproduction de pompes d’efflux.

Les porines représentent une fraction substantielle du nombre total de protéines OM et favorisent la diffusion de solutés d’une masse moléculaire allant jusqu’à 600 Da. E. coli produit deux principales porines générales : OmpC et OmpF1. Les canaux OmpF/C présentent une forme de sablier, la partie la plus étroite étant appelée zone ou région de constriction (ZC) en raison du repliement de la boucle L3. La boucle L3 génère également un fort champ électrique transversal à travers la ZC, résultant d’une rangée de résidus chargés positivement sur la paroi du tonneau faisant face à des résidus chargés négativement sur la boucle L3. Ce champ électrique a des conséquences directes sur la perméation moléculaire2. Les structures de plusieurs orthologues OmpF/C ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Malgré des similitudes structurales, les porines OmpC possèdent un rayon de pores plus petit, une conductance plus faible, une sélectivité cationique plus élevée et une intensité de champ électrique transversal plus faible. Les expériences de prédiction des perméabilités et de gonflement des liposomes ont montré que la charge atomique et la taille des solutés constituent des limitations majeures à leur diffusion à travers les porines3. Nous avons récemment montré que la ceftazidime (CAZ), qui présente une charge négative nette, est active sur les bactéries exprimant les porines OmpF. En revanche, le céfépime zwitterionique (FEP) tue les bactéries quelle que soit la porine exprimée. La quantification des molécules accumulées par chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) et les expériences sur des systèmes isolés ont confirmé que CAZ présente une préférence pour OmpF pour pénétrer dans les bactéries4.

La spécificité des porines vis-à-vis des antibiotiques est une question importante pour l’efficacité des antibiotiques et le développement de nouvelles molécules antibactériennes. Ici, notre objectif est de développer une approche utilisant la biochimie des protéines et la biophysique (Site-directed spin labeling (SDSL) Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy) afin de mesurer des différences d’affinité entre molécules antibactériennes et les porines. Les porines purifiées Omp35 et Omp36 de K. aerogenes seront reconstituées dans des liposomes selon un protocole favorisant l’orientation « outside-out ». Dans un premier temps, l’orientation de ces porines sera testée. Pour cela, des substitutions en cystéine seront réalisées dans des boucles extra- et intracellulaires des deux porines. La fonctionnalité et la structure globale de tous les mutants générés et purifiés seront analysés par des tests phénotypiques in vivo et par dichroïsme circulaire in vitro. Les protéoliposomes contenant ces variants reconstitués seront alors incubés avec un fluorophore spécifique des cystéines, et extincteur de fluorescence imperméable aux membranes en absence ou en présence de détergent5. De la même façon, l’extinction du signal RPE de la protéine marquée avec un marqueur de spin de type nitroxyde sera étudiée en fonction de l’orientation de la protéine. Une analyse biophysique complète (taille, hétérogénéité) sera réalisée sur les protéoliposomes formés avant et après incorporation de la protéine marquée (sonde fluorescente ou sonde nitroxyde) par diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Light Scattering, DLS).

Dans un second temps, les changements de conformation potentiels des porines Omp35 et Omp36 en présence d’antibiotiques seront analysés. Pour cela, nous avons sélectionné des acides aminés dans Omp35 et Omp36 situés en dessus et en dessous de la ZC qui seront individuellement substitués en cystéine pour un marquage avec une sonde magnétique. Tous les mutants ont été générés par mutagenèse dirigée en utilisant les plasmides pColdIV-omp35/36 comme matrices et exprimés dans BL21Δomp8. Les niveaux d’expression des mutants ainsi que leur localisation correcte à la membrane externe seront testés avant purification par chromatographie échangeuse d’ions (protocole interne MCT). En parallèle, les mêmes mutations seront générées dans les plasmides pBAD24-omp35/36 pour confirmer qu’elles n’affectent pas la sensibilité aux antibiotiques chez E. coli K12. Les protéines mutantes Cys seront marquées avec une sonde nitroxyde et les spectres RPE seront analysés en l’absence et en présence d’antimicrobiens (FEP et CAZ). Des changements spectraux sont attendus si l’antibiotique entre en contact avec la sonde nitroxyde et établit des interactions favorables lui permettant de traverser la région de constriction et d’atteindre la sortie du canal68. Le résultat positif de ces expériences fournira un test in vitro rapide et puissant pour cribler toute une bibliothèque chimique d’antimicrobiens et déterminer la capacité de certaines molécules à pénétrer à travers les porines des entérobactéries.

Détails de l'annonce

  • Profil : M2 student in structural biology : Techniques utilisées : - Microbiologie : détermination de concentrations minimales inhibitrices - Biochimie : purification et reconstitution de protéines membranaires en protéoliposomes et tests d’orientation - Biophysique : SDSL-EPR, CD, DLS
  • Durée de contrat : 6 mois
  • Date de prise de fonction : 01/02/2025
  • Documents à fournir pour candidater : CV, Lettre de recommandation
  • Date limite de candidature : 30/09/2024

Personne à contacter

  • Nom : MARTINHO Marlène et MASI Muriel
  • Téléphone : 04 91 16 45 57
  • Email : mmartinho@imm.cnrs.fr et muriel.masi@univ-amu.fr